Jerzy urodził się 13 kwietnia 1871 roku w wielodzietnej rodzinie litewskiej, we wsi Lugine koło Mariampola na Litwie. Oboje rodzice umarli, gdy był małym dzieckiem. Był wychowywany przez swojego starszego brata Jana, niezwykle surowego i wymagającego człowieka. Pomimo kłopotów zdrowotnych i materialnych - często nie miał za co kupić podręczników - uczył się dobrze dzięki swojej niezwykłej pilności i pracowitości. Po kilku latach nauki na prawach eksternisty w gimnazjum (od 1883 r.) zachorował na gruźlicę kości. Musiał posługiwać się kulami. Choroba ta gnębiła go do końca życia. Już w gimnazjum pragnął zostać kapłanem. Jednakże dopiero w 1891 roku, jako dwudziestoletni młodzieniec, wstąpił do seminarium duchownego w Kielcach. Wówczas też zmienił swoje nazwisko z Matulaitis na Matulewicz. Zapamiętano go jako kleryka pełnego spokoju, wewnętrznej równowagi, otwartego i pracowitego. Gdy władze carskie zamknęły seminarium, kontynuował naukę w Warszawie, a następnie w Petersburgu. Tu przyjął święcenia kapłańskie 31 grudnia 1898 roku. W następnym roku ukończył Akademię Petersburską jako magister teologii. Doktorat uzyskał na uniwersytecie we Fryburgu Szwajcarskim.

Tymoteusz był wiernym i oddanym uczniem oraz współpracownikiem św. Pawła. Św. Paweł nazywa go "najdroższym synem" (1 Kor 4, 17), "bratem" (1 Tes 3, 2), "pomocnikiem" (Rz 16, 21), którego wspomina ze łzami w oczach (2 Tm 1, 4).
Kiedy Apostoł Narodów zatrzymał się w czasie swojej drugiej podróży w miasteczku Listra, nawrócił dwie Żydówki: kobietę imieniem Lois i jej córkę, Eunikę. Synem tejże Euniki, a wnukiem Lois był św. Tymoteusz. Jego ojcem był zamożny Grek, poganin, który jednak pozwolił babce i matce wychować Tymoteusza w wierze mojżeszowej. Tymoteusz był młodzieńcem wykształconym. Znał Pismo święte i często się w nim rozczytywał. Wyróżniał się dobrymi obyczajami. Chrzest przyjął z rąk św. Pawła. Dlatego słusznie Apostoł nazywał go swoim synem. Dla ułatwienia Tymoteuszowi pracy wśród rodaków św. Paweł poddał go obrzezaniu.
Św. Paweł często wysyłał Tymoteusza w trudnych i poufnych sprawach do poszczególnych gmin, które założył, m.in. do Koryntu, Filippi i Tesalonik. Jego też wyznaczył na biskupa Efezu, ówczesnej metropolii Małej Azji i stolicy rzymskiej prowincji. W czasie swoich podróży po Małej Azji, Achai (Grecji) i do Jerozolimy św. Paweł zabierał ze sobą Tymoteusza do pomocy w posłudze apostolskiej. Święty uczeń dzielił także ze swoim mistrzem więzienie w Rzymie (Flp 2, 19-23). Dwa Pawłowe listy do Tymoteusza znajdują się w kanonie ksiąg Nowego Testamentu. Paweł wydaje mu najpiękniejsze świadectwo i daje pouczenia, jak ma rządzić Kościołem w Efezie.