Ambroży urodził się około 340 r. w Trewirze, ówczesnej stolicy cesarstwa (dziś w Niemczech). Jego ojciec był namiestnikiem cesarskim, prefektem Galii. Biskupstwo powstało tu już w wieku III/IV, od wieku VIII było już stolicą metropolii. Po św. Marcelinie i po św. Uraniuszu Satyrze, Ambroży był trzecim z kolei dzieckiem namiestnika.
Podanie głosi, że przy narodzeniu Ambrożego, ku przerażeniu matki, rój pszczół osiadł na ustach niemowlęcia. Matka chciała ten rój siłą odegnać, ale roztropny ojciec kazał poczekać, aż rój ten sam się poderwał i odleciał. Paulin, który był sekretarzem naszego Świętego oraz pierwszym jego biografem, wspomina o tym wydarzeniu. Ojciec po tym wypadku zawołał: "Jeśli niemowlę żyć będzie, to będzie kimś wielkim!". Wróżono, że Ambroży będzie wielkim mówcą. W owych czasach był zwyczaj, że chrzest odkładano jak najpóźniej, aby możliwie przed samą śmiercią w stanie niewinności przejść do wieczności. Innym powodem odkładania chrztu świętego był fakt, że ten sakrament przyjęcia do grona wyznawców Chrystusa traktowano nader poważnie, z całą świadomością, że przyjęte zobowiązania trzeba wypełniać. Dlatego Ambroży przez wiele lat był tylko katechumenem, czyli kandydatem, zaś chrzest przyjął dopiero przed otrzymaniem godności biskupiej. Potem sam będzie ten zwyczaj zwalczał.
Po śmierci ojca, gdy Ambroży miał zaledwie rok, wraz z matką i rodzeństwem przeniósł się do Rzymu. Tam uczęszczał do szkoły gramatyki i wymowy. Kształcił się równocześnie w prawie. O jego wykształceniu najlepiej świadczą pisma, które pozostawił. Po ukończeniu nauki założył własną szkołę. W 365 roku, kiedy Ambroży miał 25 lat, udał się z bratem św. Satyrem do Syrmium (dzisiejsze Mitrovica), gdzie była stolica prowincji Pannonii. Gubernatorem jej bowiem był przyjaciel ojca, Rufin. Pozostał tam przez 5 lat, po czym dzięki protekcji Rufina Ambroży został mianowany przez cesarza namiestnikiem prowincji Ligurii-Emilii ze stolicą w Mediolanie. Ambroży pozostawał na tym stanowisku przez 3 lata (370-373). Zaledwie uporządkował prowincję i doprowadził do ładu jej finanse, został wybrany biskupem Mediolanu, zmarł bowiem ariański biskup tego miasta, Auksencjusz. Przy wyborze nowego biskupa powstał gwałtowny spór: katolicy chcieli mieć biskupa swojego, a arianie swojego (arianizm kwestionował równość i jedność Osób Trójcy Świętej, został potępiony ostatecznie na Soborze Konstantynopolitańskim w 381 r.).
Ambroży udał się do kościoła na mocy swojego urzędu, jak również dla zapobieżenia ewentualnym rozruchom. Kiedy obie strony nie mogły dojść do zgody, jakieś dziecię miało zawołać: "Ambroży biskupem!" Wszyscy uznali to za głos Boży i zawołali: "Ambroży biskupem!" Zaskoczony namiestnik cesarski prosił o czas do namysłu. Skorzystał z nastającej nocy i uciekł z miasta. Rano jednak ujrzał się na koniu u bram Mediolanu. Widząc w tym wolę Bożą, postanowił jej więcej się nie opierać. O wyborze powiadomiono cesarza Walentyniana, który wyraził na to swoją zgodę. Dnia 30 listopada 373 r. Ambroży przyjął chrzest święty i wszystkie święcenia, a 7 grudnia został konsekrowany na biskupa. Rozdał ubogim cały swój majątek. Na wiadomość o wyborze przesłali Ambrożemu swoje gratulacje papież św. Damazy I i św. Bazyli Wielki.
Pierwszym aktem nowego biskupa było uproszenie św. Bazylego, by przysłał mu relikwie św. Dionizego, biskupa Mediolanu, wygnanego przez arian do Kapadocji (zmarł tam w 355 r.). Św. Bazyli chętnie wyświadczył tę przysługę delegacji mediolańskiej. Relikwie powitano uroczyście. Z tej okazji Ambroży wygłosił porywającą mowę, którą wszystkich zachwycił. Odtąd będzie głosił słowo Boże przy każdej okazji, uważając nauczanie ludu za swój podstawowy pasterski obowiązek. Sam również w każdy Wielki Post przygotowywał osobiście katechumenów na przyjęcie w Wielką Sobotę chrztu. W rządach był łagodny, spokojny, rozważny, sprawiedliwy, życzliwy. Kapłani mieli więc w swoim biskupie najpiękniejszy wzór dobrego pasterza.